作者：陈青川,于文莲,王 静

摘要:采用反相高效液相色谱法,一次进样、同时测定食品中的人工合成甜味剂(糖精钠、安赛蜜、甜味素)、防腐剂(苯甲酸、山梨酸)、*、可可碱和茶碱。以ａｌｌｔｅｃｈｅｃｏｎｏｓｐｈｅｒｅｃ18柱(150ｍｍ×4 6ｍｍｉ.ｄ.,3μｍ)为分离柱,10ｍｍｏｌ/ｌｎａｈ2ｐｏ4(ｐｈ4 00) 乙腈(体积比为90∶10)为流动相,采用二极管阵列检测器进行检测。整个分离过程在23ｍｉｎ内完成。样品平均加标回收率为78 5%～107 2%。方法也可用于药品分析。

关键词:高效液相色谱法;食品添加剂;人工合成甜味剂;防腐剂;*;可可碱;茶碱

1 前言

近年来,由于消费者对于食品的性日益关注,食品中各种食品添加剂,特别是人工合成甜味剂(主要是糖精钠(ｓａ)、乙酰磺胺酸钾(安赛蜜,ａｋ)天门冬酰苯丙氨酸甲酯(甜味素,ａｓｐ))和防腐剂(苯甲酸(ｂａ)、山梨酸(ｓｏｒ))的使用情况越来越受到人们的重视。此外,*(ｃａ)、可可碱(ｔｂ)和茶碱(ｔｐ)也广泛地存在于各种食品当中[1]。因此建立一种能够同时测定食品中以上多种食品添加剂的方法十分必要。目前,大多数分析方法只能测定上述物质中的1种或少数2～3种,能够同时测定种以上物质的方法较少。所用的方法主要是高效液相色谱法[2～9]、离子色谱法[10]和毛细管电泳法[11,12]。可以同时测定以上8种食品添加剂的方法未见报道。由于高效液相色谱法同时具备分离效率高、灵敏度高和重现性好等优点,因此应是目前进行上述物质分析的方法。本文建立了一种采用反相高效液相色谱法等度洗脱,能够同时测定上述8种食品添加剂的方法,并已用于多种食品和药品的测定,结果令人满意。

2 实验部分

2 1 仪器与试剂

ｗａｔｅｒｓ600泵,717ｐｌｕｓ自动进样器,996光电二极管阵列检测器,ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ2010色谱工作站ａｌｌｔｅｃｈｅｃｏｎｏｓｐｈｅｒｅｃ18柱(150ｍｍ×4 6ｍｍｉ.ｄ.3μｍ)。ｓｅｐ ｐａｋｃ18固相萃取柱。ｈｏｒｉｂａｆ 23ｐｈ计。日立ｕ 3000分光光度计,1ｃｍ石英比色皿。

糖精钠和苯甲酸(质量浓度均为1 00ｇ/ｌ)(购自国家标准物质研究中心(北京)),*和茶碱(购自中国药品生物制品检定所),甜味素和可可碱(ｓｉｇｍａ公司产品),安赛蜜(ｓｕｐｅｌｃｏ公司产品),乙腈为色谱纯,其余试剂均为分析纯或优级纯,实验用水(18ｍω·ｃｍ)由ｍｉｌｌｉｐｏｒｅｍｉｌｌｉ ｑｒｇ超纯水系统制备。

2 2 色谱条件

流动相为10ｍｍｏｌ/ｌｎａｈ2ｐｏ4(用1ｍｏｌ/ｌｈ3ｐｏ4调至ｐｈ4 00) 乙腈(体积比为90∶10),等度洗脱,流速为0 6ｍｌ/ｍｉｎ;柱温为40℃;进样量为20μｌ;紫外波长扫描范围为195ｎｍ～320ｎｍ。以保留时间和紫外吸收谱图定性,峰面积定量。

2 3 实际样品的制备

所有样品均为市场采集的样品,按照品种将其分为饮料、蜜饯和药品等3类,其中饮料按照ｇｂ10789 1996[13]的分类方法,又可进一步分为碳酸饮料、果汁、茶饮料、含乳饮料、植物蛋白饮料和固体饮料等。所有样品稀释液*后均经0 45μｍ滤膜过滤,然后进样测定。

2 3 1 介质比较简单的饮料 经超声脱气后用水进行适当稀释。

2 3 2 介质比较复杂的饮料 经超声脱气后用水进行适当稀释,取其中5ｍｌ(对于含果肉较多的饮料,稀释后可事先在4000ｒ/ｍｉｎ条件下离心10ｍｉｎ,取上清液5ｍｌ)经固相萃取柱(事先经5ｍｌ乙腈和5ｍｌ水进行活化),然后依次用2ｍｌ10ｍｍｏｌ/ｌｎａｈ2ｐｏ4和5ｍｌ10ｍｍｏｌ/ｌｎａｈ2ｐｏ4(含体积分数为25%的乙腈)对固相萃取柱进行洗脱。所有流出液收集于25ｍｌ容量瓶中,用水定容。

2 3 3 固体饮料和药品 研成粉末,配成溶液后,再根据具体情况按上述方法进行处理。

2 3 4 植物蛋白和含乳饮料 用水适当稀释后超声10ｍｉｎ,冷却至室温,依次加入2ｍｌ0 085ｍｏｌ/ｌｋ4[ｆｅ(ｃｎ)6]和2ｍｌ0 25ｍｏｌ/ｌｚｎｓｏ4溶液,剧烈振摇2ｍｉｎ,用水定容至25ｍｌ,然后转入离心管中,在4000ｒ/ｍｉｎ条件下离心10ｍｉｎ。取上清液5ｍｌ,经固相萃取柱萃取,以下操作同“2 3 2”节。

2 3 5 蜜饯 将样品切碎,称取适量置于50ｍｌ容量瓶中,加入30ｍｌ水,超声30ｍｉｎ,加水定容至50ｍｌ。取上清液1ｍｌ,经固相萃取柱萃取,以下操作同“2 3 2”节。

3 结果与讨论

3 1 分离条件的选择

初步实验结果表明,在中性条件下,以水 乙腈(体积比为90∶10)为流动相,苯甲酸和山梨酸先后出峰,虽然可以实现基线分离,但均为严重的前伸峰。这是因为此时二者在流动相中均以阴离子的形式存在(苯甲酸和山梨酸的ｐｋａ值分别为4 19和4 76[14]),与固定相之间的相互作用较弱。此外,可可碱与山梨酸、茶碱与山梨酸的色谱峰也部分重叠。因此,应当采用酸性流动相,使苯甲酸和山梨酸在溶液中主要以中性分子的形式存在,增加与固定相之间的相互作用。考虑到甜味素只在短波长的紫外光区才具有较大吸收,为了保证方法的灵敏度,采用磷酸盐缓冲溶液为流动相,并添加一定量的乙腈。我们首先研究了乙腈体积分数为10%时,流动相中缓冲溶液ｐｈ值对分离效果的影响,结果见图1。

由图1可见,缓冲溶液的ｐｈ值在3 00～4 40的范围内,安赛蜜、糖精钠、可可碱、茶碱和*的保留时间基本不变,这主要是因为以上分析物在此ｐｈ范围内,存在形式保持不变(*、可可碱和茶碱以中性分子的形式存在[1],安赛蜜和糖精钠可能以阴离子的形式存在[10]);相反,苯甲酸、山梨酸和甜味素的保留时间均随ｐｈ值的增加而减少,这是因为在此ｐｈ范围内,以上3种分析物的存在形式发生了变化,以离子形式存在的比例逐渐增加,分析物与固定相之间的相互作用逐渐减小。甜味素的ｐｋａ1和ｐｋａ2值分别为2 96和7 37[15],在ｐｈ3 00左右,甜味素以阴离子形式存在的比例迅速增加,它与固定相之间的相互作用也在迅速减小。因此在ｐｈ3 00～3 40的范围内,甜味素在山梨酸之后出峰,而在ｐｈ3 60～4 40的范围内,甜味素在山梨酸之前出峰(此时山梨酸以阴离子形式存在的比例虽然也在缓慢增加,但主要仍以中性分子的形式存在)。此外,随着ｐｈ值的增大,苯甲酸的色谱峰在ｐｈ4 20时开始出现轻微的前伸,在ｐｈ4 40时前伸已经非常严重,在ｐｈ4 50时色谱峰已经分叉;山梨酸的色谱峰在ｐｈ4 20时也开始出现轻微的前伸,在ｐｈ4 40时前伸已经比较严重,而且与甜味素的色谱峰部分重叠。考虑到ｐｈ4 00时,8种分析物均可实现基线分离,而且流动相ｐｈ值的轻微变化不会影响各种物质的分离,整个分离时间也较短,因此*终选择流动相缓冲溶液的ｐｈ值为4 00。

我们又进一步研究了流动相中乙腈体积分数对分离的影响(图略)。结果发现,随着乙腈体积分数的增大,所有分析物的保留时间都在缩短。在苯甲酸、山梨酸和甜味素3种分析物当中,以甜味素保留时间的变化*大,当乙腈的体积分数为13%时,甜味素在苯甲酸之前出峰。另外,乙腈的体积分数为7%～8%时,甜味素和山梨酸的色谱峰部分重叠;乙腈的体积分数为12%～13%时,甜味素和苯甲酸的色谱峰部分重叠。综合考虑,*终选择流动相中乙腈的体积分数为10%。 此外,我们还研究了柱温对分离的影响。在30℃～50℃范围内,随着柱温的增加,柱压下降,所有分析物的保留时间均在缩短,分离效果也有所改善。但由于甜味素在高温下稳定性较差[16],*终选择柱温为40℃。

3 2 检测条件的选择

由于以上8种食品添加剂均具有紫外吸收,因此以往的分析方法基本上均采用紫外固定波长检测法。由于分析物的*大吸收波长不同,固定波长检测会造成测定灵敏度偏低,而且对于介质复杂的样品,也无法对峰的纯度进行确定性评价。本文采用光电二极管阵列检测器,在195ｎｍ～320ｎｍ范围内对所有分析物进行紫外波长扫描。结果发现,在实验条件下,安赛蜜、糖精钠、可可碱、茶碱、*、苯甲酸、甜味素、山梨酸的*大吸收波长分别为224 0ｎｍ,201 7ｎｍ,200 5ｎｍ,200 5ｎｍ,205 2ｎｍ,195 8ｎｍ,195 8ｎｍ和260 7ｎｍ。由于流动相在低于200ｎｍ的波长下背景的紫外吸收较高,另外考虑到应使每种分析物的测定灵敏度尽可能的大,且定量方法不致于过分复杂,因此*终决定分别采用224ｎｍ,261ｎｍ和202ｎｍ等3个波长分别对安赛蜜、山梨酸、糖精钠、可可碱、茶碱、*、苯甲酸、甜味素进行测定。此时,安赛蜜、糖精钠、可可碱、茶碱、*、苯甲酸、甜味素、山梨酸的峰面积为各自*大吸收波长时峰面积的100%,95 6%99 8%,99 5%,99 0%,28 7%,60 5%和99 9%灵敏度均能满足实际样品的测定。标准溶液在不同检测波长时的色谱图见图2,其中安赛蜜的质量浓度为4ｍｇ/ｌ,糖精钠、可可碱、茶碱、*浓度质量均为2ｍｇ/ｌ,苯甲酸、甜味素、山梨酸浓度质量均为8ｍｇ/ｌ。

3 3 干扰试验

在实验条件下,食品中可能存在的其他常见食品添加剂和有机酸如环己基氨基磺酸钠(甜蜜素)、柠檬酸、苹果酸、酒石酸和抗坏血酸等均在死时间附近出峰,对测定不会产生干扰。另外,上述物质在224ｎｍ处的紫外吸收都非常弱,因此选择224ｎｍ对安赛蜜进行定量,也有利于避免高浓度的上述物质可能造成的干扰。

3 4 线性范围、精密度和检出限

在实验条件下,所有分析物的浓度与峰面积之间均具有良好的线性关系,具体结果和检出限(ｓ/ｎ=3)均列于表1。对混合标准溶液(安赛蜜质量浓度为10ｍｇ/ｌ,糖精钠、可可碱、茶碱、*质量浓度均为5ｍｇ/ｌ,苯甲酸、甜味素、山梨酸质量浓度均为20ｍｇ/ｌ)平行测定10次,相对标准偏差分别为安赛蜜1 46%、糖精钠1 20%、可可碱0 22%、茶碱0 24%、*0 24%、苯甲酸0 84%、甜味素0 22%、山梨酸0 53%。

3 5 实际样品的测定 每种样品平行测定4次,其中植物蛋白饮料中各种分析物均未被检出,其余样品的测定结果列于表2(表中分析物未列出者为所有样品中未检出)。加标回收率的实验结果列于表3。本方法在一年内,对60多种实际样品进行了分析,结果令人满意。

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