肖 湘 卢 刚 张 捷 俞丽君 张尔贤(汕头大学理学院生物学系,汕头515063)

现代科学研究表明,食品的营养与其天然颜色密切相关,天然颜色较深的黑色食品含有较合理的营养和有利长寿的成分。已有文献报道对黑色素的抗氧化功效进行实验研究,如黑蝌蚪色素具有抗脂质过氧化的作用[1],本文对几种黑色食品色素氧自由基的功效和抗脂质过氧化活性进行初步探讨,为开发黑色食品色素提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 铜藻(ｓａｒｇａｓｓｕｍｈｏｒｎｅｒ) 从福建省东山县采集。先进行清洗,除去泥沙,然后取色泽较深的藻叶晾干备用。

1.1.2 黑豆 市售,取其表皮。

1.1.3 黑米 市售。

1.2 仪器及试剂

751 ｇｗ型分光光度计(上海分析仪器厂);ｒｅ47型旋转蒸发仪(ｙａｍａｔｏｓｃｉｎｔｉｆｉｃ公司);次黄嘌呤(ｆｌｕｋａ公司);黄嘌呤氧化酶(酶活力0 6ｕ/ｍｇ,蛋白8 9ｍｇ/ｍｌ,广州医学科研所);2 脱氧 ｄ核糖(ｓｅｒｖａ公司);其他试剂均为国产,分析纯。

1.3 色素提取[2,3]

1.3.1 铜藻色素提取 称取10ｇ干藻叶,用50℃水浸泡(几秒钟),立即沥干,然后剪成约1ｃｍ2的碎片,加80%的乙醇(1∶15)于80℃水浴中提取4ｈ,取出抽滤,滤渣重复抽提2次,合并3次滤液。

1.3.2 黑米色素提取 称取1ｇ黑米,加入80%的乙醇(1∶5)在80℃水浴中提取40ｍｉｎ,抽滤,滤渣重复抽提,合并两次滤液。

1.3.3 黑豆皮色素提取 称取1ｇ黑豆皮,加入80%的乙醇(1∶30)在80℃水浴中提取2ｈ,抽滤,滤渣重复抽提,合并两次滤液。将上述滤液用旋转蒸发仪将大部分乙醇除去,再用真空干燥器将剩余物干燥成粉末,用包有黑纸的玻璃瓶分装,室温保存。

1.4 活性氧体系建立

1.4.1 抑制脂质过氧化(ｌｐｏ)采用ｆｅ2+诱发卵黄脂蛋白ｐｕｆａ过氧化体系 依文献[4]为基础,略加修改。样品抗氧化活性(ａｏａ)用卵黄脂蛋白ｌｐｏ的抑制率(%)表示。

1.4.2 抑制ｔｂａｓ生成体系的抗氧化活性测定:依文献[5]为基础,略加修改。以2 脱氧ｄ 核糖作为·ｏｈ自由基分子探针的反应体系,通过检测脱氧核糖降解产物与硫代*酸(ｔｂａ)的显色反应,以抑制ｔｂａｓ生成量确定活性。

1.4.3 超氧阴离子(ｏ2 )的作用:采用文献[6]方法。绘制发光抑制率的曲线,求出ｉｃ50。

1.5 色素特性鉴定

1.5.1 三种色素的光吸收特征曲线在450ｎｍ～850ｎｍ范围内进行光吸收的扫描,得到其可见光区的吸收曲线。

1.5.2 稳定性试验

1.5.2.1 溶剂对色素稳定性的影响

取新鲜配制的色素水溶液,以蒸馏水作空白,每隔6天于*大吸收波长处测定光吸收(ａ)值。

以第1天的ａ值作为100,求保存率。另用50%的乙醇作溶剂,其余步骤同上。

1.5.2.2 温度及光线对色素稳定性的影响取新鲜配制的色素水溶液,以蒸馏水作空白,每隔3天于*大吸收波长处测定光吸收值,色素水溶液分别在室温见光、室温避光、低温(6℃)且避光三种条件下保存。

1.5.3 一些定性实验 包括(1)溶解性实验;(2)色泽与ｐｈ值;(3)盐酸 镁粉反应;(4)莫立许反应;(5)醋酸铅沉淀作用;(6)ｆｅｃｌ3显色反应;(7)斐林反应。

2 结果与讨论

2.2 三种色素对ｔｂａｓ生成的抑制作用

以硫脲作为本体系的阳性对照(图2),黑米色素当用量0 3ｍｇ时抑制率为22 65%;黑豆皮色素用量为0 24ｍｇ时,其抑制率为33 25%;铜藻色素用量0 3ｍｇ时,其抑制率为16 00%。比较3者的抑制能力,以黑豆皮色素*强,黑米色素次之,铜藻色素*小。

2.3 三种色素对ｏ2 的作用

以ｓｏｄ作为本体系的阳性对照(图3),3种色素对ｏ2 的作用随色素在体系中的浓度增大而增大,3种色素的ｉｃ50分别为:黑米色素0 052ｍｇ/ｍｌ,黑豆皮色素0 031ｍｇ/ｍｌ,铜藻色素0 138ｍｇ/ｍｌ,以黑豆皮色素的抑制活性*高,黑米色素次之,铜藻色素*低。

2.4 色素的特性鉴定

2.4.1 三种色素的光吸收曲线 实验表明,3种色素的光吸收特征曲线图形基本一致(图4),3种色素的*大吸收波长分别为:黑米525ｎｍ、黑豆520ｎｍ、铜藻685ｎｍ。它们虽同属黑色食品色素,但光吸收的峰值并不完全一致。光吸收特征显示物质的结构特征,说明前述不同色素的抗氧化与氧自由基能力的差异是与色素的结构组成有关。

2.4.2 色素溶液的稳定性 分别测定了水与50%乙醇为介质对色素稳定性的影响,结果表明,50%乙醇介质不仅可大大减缓吸光度的下降,还可长时间保持色素颜色不变。如黑米色素以水为保存介质时,经过6ｄ,其平均损失率为5 3%;而以50%乙醇为保存介质,其平均损失率仅为2 6%,为水的一半。同样,黑豆皮色素以乙醇为介质的平均损失率比水降低了72 7%;铜藻色素的平均损失率降低了7 4%。此外,色素的损失率均出现由开始时较快,随后减缓的趋势。

对温度与光线的影响测定中发现,低温和避光储存的色素保存率均比室温散射光下储存的要高,其中以低温效果较好。如黑米色素水溶液保存3天后,室温下见光的色素平均损失率为9 9%,而室温下避光的色素,其平均损失率仅6 2%;低温下色素的平均损失率明显下降,降低为1 2%。同样,色素的平均损失率也出现开始时较快,随后减缓的规律。分析表明,铜藻色素的平均损失率是3种色素中*小的。

2.4.3 色素的定性实验

2.4.3.1 溶解性 3种色素能溶于极性溶剂(如水、酸、醇),溶解后呈现不同程度的红色。而难溶于非极性溶剂(如石油醚,苯,甲苯,ｃｃｌ4)。

2.4.3.2 色泽与ｐｈ值 黑米色素和黑豆皮色素在酸性介质中呈鲜红色,在弱碱性介质中呈暗红 色,在强碱性介质中呈黄绿色;在中性介质中黑米色素呈暗红色,黑豆皮色素呈淡红色。

2.4.3.3 盐酸 镁粉反应 含有镁粉的提取液经振荡后加入盐酸,结果提取液与所产生的气泡均成鲜红色。若不加镁粉而直接滴加浓盐酸,结果除无气泡外,其他现象均相同。表明具有黄酮类化合物的性质。

2.4.3.4 莫立许反应 在色素的稀乙醇溶液中加入莫立许试剂后振荡均匀,倾斜试管,沿试管壁加入浓硫酸,结果在乙醇相与浓硫酸相的交界面有紫色环出现,乙醇相为浅红色,浓硫酸相为淡绿色。从结果可以看到,这几种色素具有糖的性质。由于黄酮类化合物大多数以甙的形式存在,这与结果相吻合。

2.4.3.5 醋酸铅沉淀作用 在色素的乙醇溶液中滴入新配制的饱和中性醋酸铅水溶液后立即产生蓝灰色浑浊,随着铅溶液的滴加,蓝灰色浑浊逐渐增加,久置后形成蓝灰色沉淀,溶液变成淡蓝色。这也表现出黄酮类化合物的显色反应。

2.4.3.6 ｆｅｃｌ3显色作用 向色素的乙醇溶液滴入新配制1%ｆｅｃｌ3水溶液1滴,经振荡后溶液变成深褐色。表明具有酚羟基的特征反应,这与黄酮类分子中碳位上带有酚羟基相一致。

2.4.3.7 斐林反应 向色素的水溶液加入斐林甲乙两种试剂的等量混合液,沸水浴加热出现红色沉淀物。表明黄酮甙的糖甙含有还原糖。

从以上结果可以看到这几种色素应属于黄酮类化合物。其抗氧化机理是作为自由基的接受体而阻断自由基连锁反应[10]。自由基是生物组织代谢的产物,当体内自由基产生过多或自身防御系统薄弱时,会导致大量膜内多不饱和脂肪酸发生过氧化作用,*终导致多种炎症、变态性、脏器损伤、衰老等一系列病变的发生。适当引入外源性抗氧化剂,可以减缓或改善自由基引起的。活性氧的拮抗物研究对认识衰老生物学和多种(例如癌细胞生长、辐射损伤、关节炎等)的机理有着十分重要的意义。目前已经广泛使用的食品抗氧化剂有生育酚、抗坏血酸及其衍生物等,而黄酮类化合物是尚待开发的天然食品抗氧化剂。通过本研究证明了黑色食品中的天然色素对ｌｐｏ,·ｏｈ,ｏ 都有很好的作用,且由于天然色素的性,可以广泛用于食品和化妆品工业。进一步探讨更多的黑色素氧自由基功效与抗氧化活性对于开发黑色素和黑色食品都有重要意义。

参考文献

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